兔骨髓间充质干细胞分离培养后的活力检测

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.01.010

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (1): 62-67.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.01.010

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兔骨髓间充质干细胞分离培养后的活力检测

孔根现¹^，²，蒋知新¹^，²，沙杭²，张清华¹^，²

1南方医科大学研究生学院，广东省广州市 510515
2解放军第三○五医院老年病中心，北京市 100017

收稿日期:2012-05-17 修回日期:2012-07-05 出版日期:2013-01-01 发布日期:2013-01-01
通讯作者: 张清华，主任医师，南方医科大学研究生学院，广东省广州市 510515；解放军第三○五医院老年病中心，北京市100017
作者简介:孔根现★，男，1986年生，河南省开封市尉氏县人，汉族，南方医科大学在读硕士，主要从事老年心血管病的研究。312973139@qq.com
基金资助:
国家自然科学基金资助(30971235)，课题名称：骨髓干细胞动员与移植稳定修复易损斑块的实验研究。

Isolation, culture and cell viability testing of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells

Kong Gen-xian^1,2, Jiang Zhi-xin^1,2, Sha Hang², Zhang Qing-hua^1,2

1 Postgraduate School, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China
2 Geriatric Center, the 305 Hospital of Chinese PLA, Beijing 100017, China

Received:2012-05-17 Revised:2012-07-05 Online:2013-01-01 Published:2013-01-01
Contact: Zhang Qing-hua, Chief physician, Postgraduate School, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China; Geriatric Center, the 305 Hospital of Chinese PLA, Beijing 100017, China
About author:Kong Gen-xian★, Studying for master’s degree, Postgraduate School, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China; Geriatric Center, the 305 Hospital of Chinese PLA, Beijing 100017, China 312973139@qq.com
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 30971235*

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前分离纯化骨髓间充质干细胞多采用单一的方法，对扩增培养过程中细胞活力的变化没有较为系统而全面的评估。

目的：探索体外分离培养和纯化兔骨髓间充质干细胞的方法，并对细胞的活力进行检测。

方法：采用密度梯度离心联合贴壁筛选的方法分离纯化兔骨髓间充质干细胞，从形态学、细胞表型和成骨成脂能力方面进行鉴定；并从细胞生长曲线、贴壁率和克隆形成率3个方面评估细胞活力。

结果与结论：原代细胞多呈梭形和圆形，48 h后大部分细胞贴壁，8-10 d细胞融合达80%-90%，传代周期为3-5 d；流式检测显示CD14、CD34和CD45表达阴性，CD29、CD44和CD90表达阳性；成骨诱导茜素红染色可见明显的钙结节，成脂诱导油红O染色可见大量脂肪细胞；细胞生长曲线、贴壁率及克隆形成率的结果表明第1代和第3代细胞的活力优于第5代细胞。结果说明密度梯度离心联合贴壁筛选的方法能够有效的分离纯化骨髓间充质干细胞，并能较好的保持其生物功能，在扩增传代过程中，细胞活力会有不同程度的下降。

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨髓间充质干细胞, 分离纯化, 鉴定, 生长曲线, 贴壁率, 克隆形成率, 国家自然科学基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Most of recent studies on isolation and purification of bone marrow mesenchymal stem cells adopt single methods, and there is no systematic and comprehensive evaluation on cell viabilities during amplification.
OBJECTIVE: To establish an effective method of purifying rabbit bone marrow mesenchymal stem cells and to test the cell viabilities.
METHODS: Rabbit bone marrow mesenchymal stem cells were isolated by density gradient centrifugation and adherent cultivation methods. Rabbit bone marrow mesenchymal stem cells were identified from the morphology, cell phenotype and osteogenic and adipogenic capacity. Cell viabilities were evaluated using growth curve, seeding efficiency and colony-forming efficiency.
RESULTS AND CONCLUSION: The primary cells were spindle-shaped and circular. Most of the cells attached to the dish after seeding for 48 hours. After 8 or 10 days, cells reached 80%-90% confluency and the subculture cycle was 3 to 5 days. Flow cytometry demonstrated that cells were negative for CD14, CD34 and CD45, but they were positive for CD29, CD44 and CD90. Calcium nodules were observed by alizarin red S staining. A large amount of adipose-derived stem cells were observed by oil red O staining. Cell viability of passages 1 and 3 was stronger than that of passage 5. These findings suggest that density gradient centrifugation combined with adherent cultivation can be used to effectively isolate and purify bone marrow mesenchymal stem cells and well maintain the proliferation and differentiation potential of bone marrow mesenchymal stem cells. Cell viability will be decreased to different extents during cell proliferation.
Key Words: stem cells; bone marrow-derived stem cells; bone marrow mesenchymal stem cells; isolation and purification; identification; growth curve; adherence rate; clone formation rate; National Natural Science Foundation of China; stem cell photographs-containing paper

Key words: stem cells, bone marrow-derived stem cells, bone marrow mesenchymal stem cells, isolation and purification, identification, growth curve, adherence rate, clone formation rate, National Natural Science Foundation of China, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

孔根现，蒋知新，沙杭，张清华. 兔骨髓间充质干细胞分离培养后的活力检测[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(1): 62-67.

Kong Gen-xian, Jiang Zhi-xin, Sha Hang, Zhang Qing-hua. Isolation, culture and cell viability testing of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(1): 62-67.

图/表（结果） 7

2.1 细胞的形态学特点密度梯度离心法获得的细胞在悬液中呈圆形，4 h后即可见少量细胞贴壁，48 h后首次换液，可见贴壁细胞多呈梭形和三角形。72 h后细胞开始出现分裂增殖，高倍镜下可见细胞多数双核，出现散在的细胞集落。8-10 d可见典型的集落形成，集落内细胞以成纤维样细胞为主，鱼群状排列，并且不同的集落之间相互融合，呈旋涡状表现，见图1a。传代后细胞生长速度加快，4-6 d细胞融合达80%-90%；第1代细胞中可见少量杂细胞，见图1b，经传代贴壁筛选后，细胞纯度不断提高，至第3代可见细胞状态良好，镜下见细胞均质而明亮，胞质饱满，核质清晰，细胞折光性强，见图1c。从第5代开始，细胞出现老化，表现为细胞间隙增大，排列无序，形态不规则，胞质中可见颗粒或空泡，见图1d。

图1 骨髓间充质干细胞的形态特征(×100)

Figure 1 Morphological characteristics of bone marrow mesenchymal stem cells (×100)

2.2 细胞表面标志的表达第3代细胞流式细胞仪分析结果显示：CD29，CD44，CD90的阳性率分别为97.21%，98.87%和96.20%；CD14，CD34，CD45阳性率分别为5.36%，0.36%和2.03%，见图2。

图2 骨髓间充质干细胞表面标志的表达

Figure 2 Surface antigen expression on bone marrow mesenchymal stem cells

2.3 成骨和成脂分化特征成骨诱导21 d，实验组可形成明显的钙结节，茜素红染色可见散在的钙结节，高倍镜下呈深红色，对照组无明显改变，见图3。

图3 骨髓间充质干细胞成骨诱导后茜素红染色鉴定

Figure 3 Osteogenic induction of bone marrow mesenchymal stem cells as identified by alizarin red S staining

成脂诱导14 d，实验组细胞呈圆形或多边形，胞内可见明显脂滴，油红O染色呈现鲜艳的红色，对照组未见明显变化，见图4。

图4 骨髓间充质干细胞成脂诱导后油红O染色鉴定(×400)

Figure 4 Adipogenic induction of bone marrow mesenchymal stem cells as identified by oil red O staining (×400)

2.4 细胞的生长曲线第1，3代细胞的生长曲线呈典型的“S”形，24 h内处于潜伏期，2-5 d细胞数量成倍增长，为对数增长期，细胞倍增时间约为24 h；第6天细胞融合达80%左右，细胞增殖减慢，第8天细胞接触抑制，进入停止期。第5代细胞增殖较慢，第8天细胞融合达到80%左右，仍可见细胞增殖，见图5。

图5 第1，3，5代骨髓间充质干细胞生长曲线及增量曲线

Figure 5 Growth curves and cell increment curves of bone marrow mesenchymal stem cells at passages 1, 3 and 5

2.5 细胞贴壁率接种前第1，3，5代活细胞比例分别为96%，97%和95%。结果显示：接种14 h，第1，3，5代细胞的贴壁率均可达到高值，此后维持于稳定水平，见图6，贴壁率值分别为(96.39±0.94)%，(96.04±0.81)%和(87.64±1.36)%，方差分析显示3代细胞的贴壁率不同，差异有显著性意义(P < 0.01)，组间比较显示第5代

细胞与第1，3代细胞之间差异均有显著性意义(P < 0.01)，而第1代和第3代细胞之间差异无显著性意义(P > 0.05)，说明第1，3代细胞的贴壁能力优于第5代细胞。

图6 第1，3，5代骨髓间充质干细胞的贴壁率

Figure 6 Seeding efficiency of bone marrow mesenchymal stem cells at passages 1, 3 and 5

2.6 细胞克隆形成能力第1，3代细胞接种6 d时镜下可见细胞集落，第5代细胞接种10 d时镜下可见细胞集落。16 d后终止培养，固定并染色，在白背景下肉眼可见散在的蓝色细胞集落，见图7a-c，镜下见集落内细胞排列紧密，形态近似原代细胞，周边可见散在的老化或变异的细胞，表现为宽大扁平且形状不规则，见图7d 经统计，第1，3，5代细胞克隆形成率分别为(16.5 ±2.88)%，(13.2±4.58)%和(7.7±2.16)%。方差分析显示3代细胞的克隆形成率不全相同(P < 0.01)，第1代与第3代，第1代与第5代，第3代与第5代细胞两两比较差异有显著性意义(P < 0.01)，提示随着代数的增加，克隆形成率逐渐降低。

图7 第1，3，5代细胞克隆(肉眼图)及克隆内的细胞特征(×100)

Figure 7 Clones of passages 1, 3 and 5 cells (macrograph) and morphological characteristics of cells in the clones (×100)

参考文献

[1] Lee SK, Kim Y, Kim SS,et al. Differential expression of cell surface proteins in human bone marrow mesenchymal stem cells cultured with or without basic fibroblast growth factor containing medium. Proteomics. 2009;9(18):4389-4405.

[2] Friedenstein AJ, Gorskaja JF, Kulagina NN. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs. Exp Hematol. 1976;4(5):267-274.

[3] Nauta AJ, Fibbe WE. Immunomodulatory properties of mesenchymal stromal cells. Blood. 2007;110(10):3499-3506.

[4] Bifari F, Lisi V, Mimiola E,et al. Immune Modulation by Mesenchymal Stem Cells.Transfus Med Hemother. 2008; 35(3):194-204.

[5] Bianco P, Robey PG, Simmons PJ. Mesenchymal stem cells: revisiting history, concepts, and assays. Cell Stem Cell. 2008; 2(4):313-319.

[6] Jiang Y, Jahagirdar BN, Reinhardt RL,et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 2002;418(6893):41-49.

[7] Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC,et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.Science. 1999;284(5411):143-147.

[8] Dormady SP, Bashayan O, Dougherty R,et al. Immortalized multipotential mesenchymal cells and the hematopoietic microenvironment. J Hematother Stem Cell Res. 2001;10(1): 125-140.

[9] Tropel P, Noël D, Platet N,et al. Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from adult mouse bone marrow. Exp Cell Res. 2004;295(2):395-406.

[10] Dominici M, Le Blanc K, Mueller I,et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 2006;8(4):315-317.

[11] Sermsathanasawadi N, Ishii H, Igarashi K,et al. Enhanced adhesion of early endothelial progenitor cells to radiation-induced senescence-like vascular endothelial cells in vitro. J Radiat Res. 2009;50(5):469-475.

[12] Seshi B, Kumar S, Sellers D. Human bone marrow stromal cell: coexpression of markers specific for multiple mesenchymal cell lineages. Blood Cells Mol Dis. 2000;26(3): 234-246.

引言

材料方法

设计：细胞学体外观察。

时间及地点：于2011年10月至2012年1月在解放军第三○五医院中心实验室完成。

材料：

实验动物：健康纯种新西兰大白兔，雌雄不限，四五周龄，体质量1 kg左右，由解放军海军总医院实验动物中心提供。

实验方法：

原代骨髓间充质干细胞的分离培养：穿刺抽取股骨及胫骨骨髓，与L-DMEM混匀制成单细胞悬液，注入含等体积Percoll(1.073 g/L)分离液的离心管，1 610×g离心 30 min，收集中间云雾状细胞层，以L-DMEM液重悬细胞，179×g离心5 min，重复洗涤2遍，计数并调整细胞浓度为1×10⁸ L^-¹，接种于10 cm培养皿中，于37 ℃、体积分数为5%CO₂的培养箱中培养。48 h后首次换液，弃去未贴壁及死亡细胞，此后每3 d换液1次，细胞融合达80%-90%时，胰酶消化，以1∶3的比例传代。

流式细胞术检测细胞表面标志：取第3代细胞，消化计数，重悬细胞浓度为1×10¹⁰ L^-¹，每个流式管各取100 μL分别加入CD14、CD29、CD34、CD44、CD45、CD90抗体及其同型对照抗体，4 ℃避光孵育30 min，加入细胞洗液漂洗2次，去上清，控干后每管加入0.5 mL固定液。上机检测，先做同型对照，调整电压至阴性区范围，再测实验管。

成骨和成脂诱导以及染色鉴定：取第3代对数生长期的细胞，消化后重悬并调整细胞浓度为1×10⁷ L^-¹，接种于放有无菌盖玻片的6孔板中常规培养，待细胞贴壁融合达到约80%时，对照组继续培养，实验组每孔加入2 mL诱导培养液，每3 d换1次液，成骨诱导21 d茜素红染色鉴定，成脂诱导14 d油红O染色，其中成骨诱导液为含体积分数为10%胎牛血清的H-DMEM液+0.1 μmol/L地塞米松+50 mg/L抗坏血酸+10 mmol/L β-甘油磷酸钠，成脂诱导液为含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM液+10 mg/L胰岛素+1 mmol/L地塞米松+0.5 mmol/L异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)+200 μmol/L吲哚美辛。

细胞生长曲线的测定：取第1，3，5代生长状态良好的细胞以0.25%的胰酶消化，以1×10⁴/孔接种于24孔板，自第2天起每天取3个孔消化计数，每孔计数3次，取其平均值，连续8 d。绘制生长曲线，取对数生长期，求得细胞数量增加一倍所需时间为倍增时间。在此基础之上，计算出每天的细胞增量，绘制增量曲线，分析3代细胞之间的差异。

细胞贴壁率检测：取第1，3，5代对数生长期的细胞，0.25%胰酶消化，锥虫蓝染色测定活细胞百分比，以3.5×10⁷ L^-¹的浓度接种于3.5 cm培养皿中，每隔2 h随机选取3个培养皿，吸取培养液与未贴壁细胞，0.25%胰蛋白酶消化，计算每个皿内细胞数，取均值，连续测定18 h，绘制曲线。

细胞克隆形成率检测：取第1，3，5代对数生长期的细胞，0.25%胰酶消化，以100个/孔接种于6孔板中，培养16 d，锥虫蓝染色计数细胞克隆，标准为≥50个细胞为1个细胞克隆，细胞克隆形成率=(克隆数/接种细胞)×100%，每代培养6个孔取平均值。

主要观察指标：细胞形态，细胞表型，成骨成脂分化能力，生长曲线，贴壁率及克隆形成率。

讨论

骨髓间充质干细胞在骨髓中的含量极低，在有核细胞中仅占0.001%-0.01%^[9]，因此，实现其分离纯化和体外扩增而不损害细胞活力是临床应用首要解决的问题。目前，体外分离培养骨髓间充质干细胞的方法主要有：全骨髓贴壁筛选法、密度梯度离心法^[8-9]、流式细胞仪分选法和免疫磁珠法。全骨髓贴壁筛选法是根据细胞贴壁能力的不同，通过换液和传代实现细胞的纯化，不但纯化时间长，而且骨髓间充质干细胞与混杂细胞共培养可能会影响其活力和功能。密度梯度离心法是根据骨髓中各种细胞的比重差异，去除骨髓中红细胞、白细胞等混杂细胞，分离出单个核细胞，实现骨髓间充质干细胞的纯化。流式细胞仪和免疫磁珠分选法对细胞活性的影响较大，实验条件要求较高，且费用昂贵，目前尚未广泛应用。本实验通过密度梯度离心的方法把骨髓中比重不同的细胞群分层，分离出含有骨髓间充质干细胞的单个核细胞，在传代的过程中，利用骨髓间充质干细胞易于消化的特点，严格控制酶量和消化时间，去除贴壁能力较强的单核细胞及成纤维细胞，从而实现了骨髓间充质干细胞的纯化。

国际干细胞治疗委员会认为确定细胞为间充质干细胞必须具备以下3种特性^[10]：贴壁的细胞；细胞表面阳性和阴性选择标记；体外具有成骨、成软骨、成脂肪等多项分化潜能。目前并未发现特异性的骨髓间充质干细胞表面标志，普遍认为造血细胞前体标记物CD34、血细胞发展阶段中的标记物(CD11a，CD45，CD235a，HLA-DR)及内皮细胞的标记物CD144在骨髓间充质干细胞中极少表达；而CD29、CD44、CD90、CD105及CD166在骨髓间充质干细胞中呈阳性表达^[11-12]。形态学、细胞表型和成骨成脂诱导的结果表明实验分离培养出来的细胞是纯度较高且具有多向分化潜能的骨髓间充质干细胞。

细胞生长曲线能够反映细胞的绝对增殖数值和生长繁殖的基本规律，细胞贴壁率可以反映细胞的生存能

力和细胞群的活力，而克隆形成率则主要反映细胞的群体依赖性和增殖能力两个重要性状，所以该3项指标能够较好的评估细胞活力。检测结果显示第1，3代细胞的生长趋势和贴壁能力较为一致，优于第5代细胞，且随着传代次数增加克隆形成率逐渐降低，这说明骨髓间充质干细胞的细胞活力在3代以内维持在一个较高的水平，此后逐渐下降。因而，基于骨髓间充质干细胞的实验研究和临床治疗宜在3代以内进行。实验不仅建立了一种骨髓间充质干细胞分离纯化的方法，而且细胞活力的测定也为进一步的基础和临床研究提供了可借鉴的依据。

文章快阅

延伸阅读

问题一：研究内容无新意，研究方法无创新，建议在此基础上定向诱导或者共培养
坦白说，在写这篇文章的时候我们自己也意识到了这一问题。本来我们主要的研究目的是用几种方法定向诱导骨髓间充质干细胞分化为血管内皮细胞，并对各自的诱导效率作一比较，但是在实验过程中我们发现，在3代以内细胞活力表现比较好，此后的活力会有不同程度的下降。起初我们以为是自己的实验方法或是操作方面引起的这种现象，于是就到阜外医院，北医三院以及解放军304医院请教和学习，但发现他们也会出现类似问题。于是，我们便想探讨一下，在现有的研究方法下，运用研究中常用的方法（密度梯度离心联合贴壁筛选）分离出来的细胞在怎样的一个时间段活力维持较好，从而适宜于我们的进一步研究和应用？我们研究的方法和材料是目前各个实验室较为通用的，确实存在内容和方法不新的问题，但从另一个方面来讲，我们的结果或许对许多的研究人员来说更有借鉴意义。
问题二：参考文献旧，没有体现研究新动向
在本篇文章中，我们是用基础的方法对细胞基本的生物特性进行研究，从而为进一步的探索提供借鉴。骨髓间充质干细胞的研究持续了这么多年，涌现出大量的经典文献，我们在投稿时提供的引用文献选择了以往引用度较高的文献，从而出现了参考文献过旧的缺点，在修改文中我们会尽量引用新近发表但可信度高的文献。
问题三：很多研究者证实P1、P3、P5代的骨髓间充质干细胞的活性并无明显差别，由此对作者提出的P1和P3代细胞的活力优于P5代细胞存在异议。
对于这一问题，我们也看到了许多这方面的文献，确实有很多研究者提出P1、P3、P5代的骨髓间充质干细胞的活性无明显差别，但是我们发现在生长曲线，贴壁率，克隆形成率这三个指标中，多数的研究者检测的指标仅限于一到两个，一般都是作为深入研究前辅助检测，没有针对间充质干细胞的细胞活力专门的报道。
我提到在诱导实验过程中我们发现P3代之后细胞活力会下降，别的实验室也有类似情况出现，正是因为与许多研究者报道的不同，所以我们提出了自己的看法，希望能和大家交流和探讨，以获得进步和提高。
问题四：提供的P0、P1、P3、P5代细胞培养照片时间点不同。
提供的P0、P1、P3、P5代细胞培养照片时间点不同是因为在结果2.1中我们提到P0代细胞从骨髓中分离出来接种时密度较低，有杂细胞存在的条件下生长较慢，8-10 d才可见典型的集落形成，因而P0代细胞我们选择提供第8 d的图片；传代以后，细胞增殖速度加快，纯度不断提高，4-6 d即可达到P0代细胞8-10 d的融合度，因而为了比较融合度相同情况下的细胞形态特点，P1、P3、P5代细胞我们选取了5或6 d时的图片。
问题五：P1、P3、P5代细胞贴壁率未做统计学分析。三代不同细胞克隆率的照片缺，数据分析牵强。
P1、P3、P5代细胞贴壁率的结果我们只做了曲线的直观呈现，确实缺少相关的统计学分析，这一点我们在修改稿中会补上。
因为细胞克隆的形成是由单个或者是为数不多的几个细胞通过分裂增殖形成细胞数目＞50的细胞集落，所以能够形成克隆的细胞都是增殖能力相对较好的细胞。之所以没有提供细胞克隆的图片是因为细胞克隆形成后三代细胞间只有克隆的数目不同，镜下观察单个克隆内细胞的分布和形态特点并没有明显区别。但是为了说明数据来源的可靠性我们会在修改稿中补充三代细胞克隆的图片。

[1]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[2]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[3]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[4]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[5]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[6]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[7]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[8]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[9]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[10]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[11]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[12]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[13]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.
[14]	梁学奇, 郭黎姣, 陈贺捷, 武杰, 孙雅琪, 邢稚坤, 邹海亮, 陈雪玲, 吴向未. 泡状棘球绦虫原头蚴抑制骨髓间充质干细胞向成纤维细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 996-1001.
[15]	樊全宝, 罗惠娜, 王丙云, 陈胜锋, 崔连旭, 江文康, 赵明明, 王静静, 罗冬章, 陈志胜, 白银山, 刘璨颖, 张晖. 低氧培养犬脂肪间充质干细胞的生物学特性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1002-1007.

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